En este proyecto proponemos realizar estudios acerca del mecanismo de acción y estructura de la fructosa-1,6-bisfosfatasa de rinón de cerdo (FBPasa), enzima alostérica que cumple una función preponderante en la regulación de la gluconeogénesis. La FBPasa es un tetrámero que responde a una variedad de senales metabólicas: es regulada por inhibición por concentraciones micromolares de AMP y fructosa-2,6-bisfosfato (Fru-2,6-P2) y por altas concentraciones de Fru-1,6-P2. Existe además un potente sinergismo en las inhibiciones provocadas por Fru-2,6-P2 y AMP, efecto que se piensa es el principal mecanismo de control del flujo de la vía gluconeogénica. A través del trabajo que se propone esperamos avanzar en la comprensión molecular de los mecanismos que regulan su función, es decir, los procesos que rigen el plegamiento y la asociación específica de subunidades, la localización intracelular y la interacción de ella con otras proteínas. Estos procesos han recibido muy poca atención, aún cuando en los últimos anos se ha avanzado notablemente en el conocimiento sobre la estructura y el esclarecimiento del mecanísmo catalítico y de su regulación por la unión de ligandos. En base a estos antecedentes, proponemos probar la siguiente hipótesis: La función de la fructosa-1,6-bisfosfatasa es regulada por el efecto de sus ligandos sobre su estructura, plegamiento y la interacción proteína-proteína, junto a la modulación de la localización subcelular ejercida por metabolitos intermedarios. Uno de los corolarios de esta hipótesis es que en la FBPasa nativa la unión de AMP a la enzima debiera ocurrir por medio de un mecanismo secuencial, y que debieran existir sitios de unión diferentes para el sustrato y el inhibidor Fru-2,6-P2. Otro corolario es que en la FBPasa las interfases intersubunidades C1-C2, adyacente al sitio activo y la interfase C1-C4, adyacente al sitio alostérico para AMP, no son equivalentes en términos de estabilidad, y los ligandos tienen un papel esencial en la adquisición de la estructura tridimensional nativa. Un tercer corolario es que la enzima contiene en su estructura primaria una senal responsable para su localización subcelular. Este proceso dinámico debiera ser modulado por la acción de metabolitos específicos y por su asociación a otras proteínas, por ejemplo aldolasa B, constituyendo un nuevo mecanismo de regulación metabólica de FBPasa. Para comprobar nuestra hipótesis proponemos, por una parte, analizar el mecanismo de la asociación entre las subunidades durante el plegamiento y la desnaturación de la FBPasa, y analizar el efecto de la unión de ligandos sobre estos procesos. Para esto emplearemos mutantes de la enzima en las cuales ciertos residuos fenilalanina son remplazados por residuos de triptófano: Phe6Trp, Phe16Trp, Phe89W, Phe219Trp y Phe232Trp. Estas sustituciones nos permitirán sensar mediante fluorescencia, los cambios conformacionales locales que suceden en la proteína y el efecto de la unión de sus ligandos en el proceso de desnaturación y plegamiento in vitro . También nos permitirán sensar y medir la unión de ligandos a la enzima y con ello esperamos responder a la antigua controversia si el inhibidor fructosa-2,6-fosfato se une al mismo sitio de unión del sustrato o a un sitio diferente. Paralelamente, se probará que la unión de AMP a la enzima debiera ocurrir por un mecanismo secuencial. Con este propósito, se determinarán las constantes y la estequiometría de unión de AMP para las mutantes Arg49Ala y Lys50Ala, utilizadas previamente por nuestro laboratorio para demostrar el papel decisivo de los residuos Arg49 y Lys50 en la propagación de la senal cooperativa entre los sitios de unión de AMP, como también la importante participación de la interfase C1-C2 (C3-C4) en el mecanismo de regulación alostérica (Cárcamo et al., (2000) Eur. J. Biochem. 267, 2242-2251). Por otra parte, planteamos que la distribución compartimentalizada o zonal que muestran la FBPasa y aldolasa B, en los tejidos renal y he