Desarrollar y evaluar un biocontrolador en base a bacterias nativas para el control biológico eficiente de Phytophthora cinnamomi en nogal (Juglans regia).

- Identificar a nivel microbiológico, bioquímico y molecular las cepas bacterianas silvestres que presentan actividad antagonista frente P. cinnamomi. El objetivo contempla dos aspectos relevantes para el proyecto. En primer lugar la clasificación taxonómica permitirá completar la identificación de aquellas cepas bacterianas que no estén completamente caracterizadas, la información obtenida se utilizará para determinar género y especie de cada. Una vez identificadas las bacterias se procederá a la selección de microorganismos inocuos, es decir, en base a la identificación se descartarán aquellos aislados que resulten patógenos. La identificación permitirá al mismo tiempo optimizar las condiciones para el crecimiento bacteriano a escala de laboratorio. Es importante destacar que para cumplir con la normativa vigente para este tipo de productos será necesario en etapas posteriores realizar ensayos toxicológicos de la formulación final. - Identificar las moléculas con propiedades antagonistas contra P. cinnamomi secretadas por las bacterias previamente seleccionadas. El conocimiento de las moléculas producidas por los microorganismos permitirá determinar las mejores combinaciones de cepas bacterianas para generar la formulación del controlador, teniendo como premisa utilizar cepas que generen diferentes tipos de principios activos. Por este motivo, se identificarán las moléculas responsables de la capacidad de control ejercida por las bacterias frente al patógeno. Al determinar su estructura es muy probable que en algunos casos se encuentren moléculas previamente descritas en la literatura por lo que la diferenciación de nuestro producto estará dada por el uso de mezclas de diferentes cepas bacterianas. También es posible que se encuentren moléculas nuevas no descritas a la fecha, lo cual entregará un aspecto novedoso mayor. - Evaluar en forma preliminar el grado de inhibición que ejercen las cepas seleccionadas sobre P. cinnamomi. Se realizarán ensayos in vitro para cuantificar la actividad controladora de las cepas individuales y de las mezclas de dos o más tipos de bacterias según sea la naturaleza de las moléculas identificadas en el objetivo anterior. Para ello será necesario realizar ensayos de antagonismo en placa contra P. cinnamomi. Aquellas cepas o mezclas que presenten los mejores resultados se utilizarán para ensayos in vivo. Mediante ensayos in vivo en plantas jóvenes de nogal infectadas con P. cinnamomi se determinará la eficiencia de las cepas bacterianas seleccionadas y mezclas de ellas (según resultado de ensayos in vitro) como agente preventivo de la enfermedad. - Desarrollar un prototipo inicial o formulación que contenga las cepas bacterianas con actividad antagonista como principio activo. Fomulaciones tipo: Las bacterias seleccionadas ( individuales o sus mezclas), serán incluídas en 2 formulaciones preliminares (formulaciones tipo desarrolladas por la empresa Biogram). Estas se aplicarán en diferentes dosis mediante riego en plantas individualizadas (sanas e inoculadas posteriormente). Análisis de eficiencia: Finalizadas las aplicaciones se determinarán las formulaciones más eficientes para el control de la enfermedad en base a la sintomatología de las plantas, el estado de la raiz y parte aerea. Escalamiento: Se optimizarán los parámetros de crecimiento de las bacterias seleccionadas en el objetivo anterior para generar biomasa suficiente (cultivos 10L) de modo de utilizarlas en formulaciones para ensayos de campo. Formulaciones: Se desarrollarán 2 formulaciones líquidas cuyo principio activo será la bacteria o mezcla seleccionada. El proceso de formulación será asesorado por personal de la empresa (entidad asociada al proyecto) BIOGRAM, reconocida empresa nacional que posee amplia experiencia en el desarrollo de formulados para sus productos biológicos. Una vez optimizada, la formulación base será evaluará el prototipo definitivo condiciones de vivero. - Evaluar a nivel de vivero el grado de protección de la formulación desarrollada que contiene la(s) cepa(s) antagonistas seleccionadas (o combinaciones de ellas) y riesgos de toxicidad. Ensayos de Campo: Se realizarán 2 ensayos el segundo año en sus plantas obetnidad de viveros comerciales, ubicados en la zona Central de Chile. Se aplicarán diferentes dosis. Análisis de eficiencia: El análisis estadístico se basará en comparaciones entre los diferentes tratamientos, realizando pruebas para variables paramétricas y no paramétricas, según sea el caso. Análisis de estabilidad: Para determinar la estabilidad de los microorganismos aplicados en el campo se tomarán muestras de suelo que serán analizadas con el fin de evaluar la persistencia de los microorganismos aplicados en el ambiente por cultivo en placas y por amplificación por PCR del ADN 16s y posterior secuenciación del producto obtenido. Análisis de toxicidad: Una vez seleccionada la formulación óptima para el control en vivero se realizarán ensayos de toxicidad como prestación de servicio de la empresa Salimax. Se considera evaluar Toxicidad inhalatoria, oral, dérmica y sensibilización cutánea '