Evaluar el efecto del precondicionamiento de células madre mesenquimales (MSCs) con moléculas exógenas, sobre la capacidad de dichas células de adquirir actividad inmunomoduladora in vitro, en un modelo celular equino, para su uso futuro en terapias regenerativas alogénicas in vivo.

1.- Se ensayará la capacidad de las tres moléculas por separado y sus combinaciones de estimular la síntesis y secreción cuantificable de medidores de la actividad inmunomoduladora de las MSCs in vitro. En células näive y precondicionadas se evaluarán por citometría de flujo los marcadores de superficie relacionados con la inmunomodulación. Adicionalmente se cuantificarán mediadores solubles: PGE2 e IL-10 por ELISAs comerciales especie específicos. Finalmente se cuantificará la actividad de la ruta Triptófano-Kinenurina por HPLC. Este enfoque múltiple permitirá contar con un completo patrón de marcadores de adquisición de capacidad inmunomoduladora por las células madre mesenquimales. 2.- Se evaluará la respuesta integral inmunomoduladora de las células (estado näive y precondicionadas) ante un panel de ensayos capaz de evaluar la inmunomodulación mediada por las MSCs de células tanto del sistema inmune nativo, como del adquirido. Las células dianas a estudiar serán linfocitos T, células B, natural killer y dendríticas, según distintos protocolos estándar. A manera de conclusión de los objetivos 1 y 2, se escogerá la mejor molécula o combinación de estas que eliciten la mejor respuesta inmunomoduladora, esto para ser usada en otros objetivos experimentales. 3.- Se evaluará la actividad biológica no relacionada con la respuesta inmune de las células precondicionadas o no. Concretamente la tri-potencia o plasticidad diferenciativa, y la migración ante estímulos atractantes. Este objetivo complementa a los dos anteriores y permitirá disponer de un completo patrón de las respuestas, tanto inmunmoduladora, como diferenciativa de las células ante los tratamientos escogidos. 4.- Se llevará a cabo un ensayo transcriptómico con microarreglos equinos de alta densidad (44 mil spots) comercialmente disponibles (4x44k Horse Gene Expression microarrays (AMADID 021322, Agilent) de las células (estado näive y precondicionadas). Para esto se utilizará la mejor molécula o su combinación que se obtenga de los objetivos anteriores. Los resultados de este objetivo permitirán generar las bases de datos para el análisis bioinformático de los resultados. 5.- Mediante herramientas bioinformáticas avanzadas se obtendrá información detallada de las bases de datos de genes y proteínas presentes (dereguladas o no) en las muestras analizadas, rutas metabólicas y su asociación con significados biológicos, análisis de composición de clases, ontología génica y funcional y análisis de correlaciones entre las variables biológicas ensayadas, empleando herramientas de análisis como Matlab por ejemplo.

i) kit para investigación y posible uso comercial, compuesto por células madre mesenquimales de caballo y al menos una molécula potenciadora de una mayor actividad inmunoduladora, ii) know-how patentable para lograr de manera estable, células madre mesenquimales con potencial de uso alogénico, basado en una actividad inmunomoduladora incrementada y iii) banco de células madre. Adicionalmente se sentaron las bases para ensayos clínicos controlados en equinos, en una segunda etapa, usando el conocimiento recabado en este proyecto.