Enzima modificada puede aumentar la producción de etanol de segunda generación

Uno de los mayores desafíos para la producción de biocombustibles de segunda generación es identificar enzimas oriundas de microorganismos que, combinados en un cóctel enzimático, viabilicen la hidrólisis de biomasa. Por ese proceso, las enzimas actúan en conjunto para degradar y convertir los carbohidratos de la paja y del orujo de la caña de azúcar, por ejemplo, en azúcares simples, capaces de sufrir fermentación.

Un grupo de investigadores de la Unicamp, en colaboración con colegas del Laboratorio Nacional de Ciencia y Tecnología del Bioetanol (CTBE), encontró que un hongo que se encuentra en la Amazonía, las especies de Trichoderma harzianum produce una enzima potencial para convertirse en el más importante en una coquetel enzimático.

La proteína, llamada β-glicosidasa, de la familia 1 de las glicosidas hidrolasas (GH1), actúa en la fase final de la degradación de la biomasa y produce glucosa libre para ser fermentada y transformada en etanol. Sin embargo, los investigadores observaron en laboratorio que esa misma glucosa producida por la reacción enzimática inhibía la actividad de la β-glucosidasa.

"También constatamos que la actividad óptima de catálisis de la proteína ocurría a 40 grados. Esto representa otro obstáculo para el uso de la enzima, ya que, en entornos industriales, la hidrólisis enzimática de la biomasa se lleva a cabo a temperaturas más altas, por lo general alrededor de 50 grados Celsius, " Clelton Ali dos Santos , post-doc en el Centro de Biología Molecular y Unicamp ingeniería genética con una beca de la FAPESP .

Por medio de análisis de la estructura de la enzima, combinadas con técnicas de genómica y de biología molecular, los investigadores lograron hacer modificaciones en la estructura de la molécula que permitieron solucionar esos problemas y aumentar de forma considerable su eficiencia en degradar biomasa.

Resultado de un proyecto regular y un tema , ambos apoyados por la FAPESP, el estudio fue publicado en la revista Scientific Reports . " Hemos encontrado que la proteína modificada desarrollado es mucho más eficiente que la enzima no modificada y se puede utilizar para complementar los cócteles enzimática comercializados hoy en día para la degradación de la biomasa y la producción de biocombustibles de segunda generación ", Santos dijo que la agencia de la FAPESP .

Para llegar a la proteína modificada, los investigadores inicialmente compararon la estructura cristalográfica de la molécula original con la de otras enzimas β-glicosidasas salvajes de las familias 1 (GH1) y 3 (GH3) de las glucósidas hidrolasas. Los resultados de los análisis revelaron que las glicosidasas GH1 más tolerantes a la glucosa presentaban un canal de entrada del sitio activo más profundo y estrecho que otras β-glucosidas. También mostraron que ese canal restringía el acceso de la glucosa al sitio activo de la enzima.

Las β-glucosidasas menos tolerantes a la glucosa poseen un canal de entrada del sitio activo más corto y ancho, que permite el acceso de una cantidad mayor de la glucosa producida por esas enzimas durante la fase final de la degradación de la biomasa. La glucosa retenida entona el canal de la proteína y disminuye su actividad catalítica.

Con base en esa observación, los investigadores hicieron, por medio de una técnica de biología molecular denominada mutagénesis sitio-dirigida, la sustitución de dos aminoácidos que podrían funcionar como "porteros" en la entrada del sitio activo de la enzima, autorizando o impidiendo la entrada de la glucosa . Los análisis de los experimentos indicaron que la modificación causó el estrechamiento del sitio activo de la enzima.

"El sitio activo de la enzima mutante pasó a tener una dimensión menor y semejante al de las β-glucosidasas GH1 más tolerantes a la glucosa", afirmó Santos.

Aumento de la eficiencia

A fin de evaluar el desempeño de la proteína mejorada en la degradación de la biomasa -especialmente del bagazo de la caña, un residuo agroindustrial con gran potencial a ser explotado en Brasil, los investigadores hicieron una serie de experimentos. A través de una estancia de investigación en el extranjero con una beca de la FAPESP , Santos analizó en colaboración con un grupo de investigadores dirigido por el profesor Paul Dupree, la Universidad de Cambridge, en Inglaterra, la eficiencia de la enzima mejorado en comparación con la liberación de glucosa en conversión de diferentes fuentes de biomasa vegetal.

Los resultados de los análisis indicaron que la enzima modificada presentó una eficiencia catalítica 300% mayor que la proteína salvaje y se volvió más tolerante a la glucosa, propiciando un aumento significativo de la liberación de azúcar de todas las fuentes de biomasa vegetal probadas. Además, la mutación aumentó la estabilidad térmica de la enzima durante la fermentación.

"La mutación de los dos aminoácidos en el sitio activo de la proteína tiene un super - enzima eficiente, listo para su aplicación industrial," dicho Anete Pereira de Souza , un profesor de la Unicamp y coordinador del proyecto. "Una de las ventajas de esta enzima es que es producido in vitro y de un no - organismo modificado, en cuyo caso el hongo. Con eso, es posible producirla en grandes cantidades y reducir los costos ", evaluó.

ARTÍCULO

Artículo Una ingeniería GH1 mejorada β-glucosidasa y muestra tolerancia a la glucosa aumento de la liberación de azúcar a partir de materiales lignocelulósicos (DOI: 10.1038 / s41598-019-41300-3) de Clelton A. Santos, Mariana AB Mitchell, M. Terrett Oliver, Jan J . Łyczakowski, Jaire A. Ferreira Filho, Celisa CC Tonoli, Mario T. Murakami, Paul Dupree y Anete P. Souza, se puede leer en la revista Scientific Reports en www.nature.com/articles/s41598-019-41300-3 .

Fuente: UNICAMP